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Genetica e microbiologia:
Gli appunti trattano gli argomenti circa che cos'è il DNA, il genoma, gli acidi nucleici, codice genetico, l'eterocromatina ed eucromatina, tipi di mutazioni e meccanismi per ridurle, malattie, legge di Hardy-Weinberg, cariotipo consulenza genetica, tecnica della fish, array CGH e PCR, real time PCR e threshold cycle, sequenziamento. Microbiologia: cos'è la microbiologia, postulati di Koch, ruoli dei microrganismi, classificazione e caratteristiche dei batteri, biotecnologie, sopra e sporogenesi, microbiologia clinica, vaccini COVID.
Dettagli appunto:
- Autore: Carlo Mantovani
- Università: Università degli Studi di Padova
- Facoltà: Medicina e Chirurgia
- Corso: Fisioterapia
- Esame: Genetica e Microbiologia
- Docente: Vincenzo di Iorio
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Genetica e Microbiologia Appunti di Carlo Mantovani Università degli Studi di Padova Facoltà: Medicina Corso di Laurea in Fisioterapia Esame: Genetica e Microbiologia Docenti: Vincenzo di Iorio A.A. 2021/2022GENETICA 06/10/2021 DNA E GENOMA Il genoma è l’intero patrimonio genetico di un organismo, dove ci sono tutte le istruzioni per lo sviluppo e le funzioni di tutte le cellule. Il genoma umano è costituito da circa 3 miliardi di paia di basi e contiene un numero di geni (ancora imprecisato) pari a circa 25.000 - 30.000. È scritto nel linguaggio del DNA, una molecola identica in tutte le cellule che costituiscono l’individuo ed è presente nel nucleo. Il DNA è la molecola depositaria dell’informazione genetica, comprende circa 25,000/30,000 geni. DNA è il termine tecnico con cui definiamo l’acido desossiribonucleico. Con il DNA identifichiamo tutto il materiale all’interno del nucleo, quindi anche i geni, ma non solo. Il DNA è una molecola tuttora misteriosa, in quanto i geni coprono solo il 2%. Rimangono ignote le zone vuote, quindi quelle senza geni. Un gene è un frammento di DNA che attraverso il processo di trascrizione origina il trascritto, il quale va incontro alla sintesi proteica. Quando parliamo di cromosoma parliamo di un estesa porzione di DNA che contiene più geni, anche centinaia o migliaia, oppure una zona priva di quest’ultimi. Parliamo di malattia recessiva quando la mutazione è recessiva, cioè non è in grado di interferire con la funzione dell’allele normale, anche se l’individuo è portatore della mutazione. Noi abbiamo circa 30.000 geni e quindi 60.000 alleli, cioè forme alternative dello stesso gene. C’è poi una correlazione tra genotipo e fenotipo (ovvero i caratteri che si manifestano) MALATTIE GENICHE E CROMOSOMICHE Tra una malattia genica e una malattia cromosomica è più grave quest’ultima, e in particolare la trisomia 1: infatti il cromosoma 1 è il più grande di tutti, contiene dunque più geni e quindi più funzioni vengono a mancare. Non necessariamente però la mutazione di un gene è inferiore a quella di un cromosoma: infatti se c’è la mutazione di un singolo gene (mutazione puntiforme) che però è indispensabile per la vita, questo comporta che anche tutto il resto non funzioni e quindi, in questo caso, avrebbe degli effetti gravissimi, anche più di una mutazione cromosomica. MALATTIE GENETICHE La malattia genetica è una condizione di malattia, causata da una o più anormalità del genotipo, che possono verificarsi a livello di un solo/singolo gene o coinvolgerne anche più di uno. In tal senso abbiamo: • Mutazione dei geni • Alterazione dei cromosomi ACIDI NUCLEICI Come è fatta la molecola di DNA? Il DNA è una molecola che ha una struttura a due eliche complementari. Il DNA non è esclusivo del nucleo, infatti anche i mitocondri lo contengono nella membrana mitocondriale. Esiste un’altra versione di DNA, ovvero l’RNA: può venire considerato un surrogato del DNA, ha anche un ruolo di sicurezza: c’è la necessità di svolgere determinate funzioni vitali e per svolgerle ho bisogno di macchinari accessori presenti nel citoplasma e per eliminare i rischi di danneggiare il DNA, quest’ultimo rimane nel nucleo. Per consentire di espletare le funzioni indispensabili per la vita, la natura ha creato delle versioni di DNA mobili, come l’RNA messaggero. L’RNA ha tre versioni: • RNA messaggero (mRNA): trasporta l’informazione genetica dal DNA al citoplasma, dove vengono sintetizzate le proteine. Per la formazione dell’mRNA è necessario l’enzima RNA polimerasi 1• RNA transfer (tRNA): trasporta gli amminoacidi liberi nel citoplasma ai ribosomi, durante la sintesi proteica e serve per tradurre l’informazione contenuta nella sequenza di nucleotidi dell’mRNA in una sequenza di amminoacidi. -L'RNA transfer (o RNA di trasporto), abbreviato in tRNA, è una piccola catena di RNA (di 74-93 nucleotidi) che trasferisce un amminoacido specifico ad una catena polipeptidica in crescita al sito ribosomiale della sintesi proteica durante la traduzione. -Il tRNA ha un sito di attacco per l'amminoacido ed una regione con tre basi (nucleotidi), chiamata anticodone, che riconosce il corrispondente codone a tre basi dell'mRNA attraverso l'appaiamento di basi complementari. -Ogni tipo di molecola di tRNA può legarsi ad un solo tipo di amminoacido, ma essendo presenti nel DNA tipi diversi di codoni che specificano uno stesso amminoacido, molti tipi di tRNA con anticodoni differenti possono portare lo stesso amminoacido. • RNA ribosomiale (rRNA): è un elemento costitutivo dei ribosomi Da un punto di vista chimico, gli acidi nucleici sono polimeri costituiti da subunità dette monomeri che concatenati uno all’altro formano la catena polinucleotidica. Il monomero è il nucleotide, costituito da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (ribosio o desossiribosio), una base azotata e un gruppo fosfato. Il nucleoside è formato dallo zucchero e dalla base azotata. Le basi si distinguono in: • puriniche (adenina e guanina) con doppio anello aromatico, più grandi • pirimidiniche (citosina, timina e uracile), più piccole I nucleotidi sono legati tra di loro con un legame fosfodiesterico (struttura primaria). La struttura secondaria è determinata dai legami ad idrogeno tra le basi azotate complementari del DNA. La duplicazione del DNA è semiconservativa: uno dei due filamenti verrà poi utilizzato per sintetizzare il filamento nuovo, quindi un filamento di origine parentale e un filamento nuovo. Questa tecnica di duplicazione semiconservativa è utile perché così si riducono i rischi di mutazione. I numeri 5’ e 3’ si riferiscono al legame tra il gruppo fosfato in posizione 5 di un nucleotide e il gruppo OH in posizione 3 nell’altro nucleotide. La DNA polimerasi non è in grado di aggiungere un nucleotide all’estremità 5’ dove è presente il gruppo fosfato, ha bisogno dell’estremità 3’, dove è presente il gruppo OH, dell’altro nucleotide, che è detto nucleotide di innesco e perciò l’aggiunta dei nucleotidi può avvenire in un’unica direzione: da 5’ a 3’ (filamento senso) La replicazione semiconservativa è il miglior sistema per ridurre le mutazioni? Il filamento vecchio nella nuova cellula non va incontro a nessuna modifica e quindi non è soggetto a mutazione. Gli errori possono verificarsi dunque nel nuovo filamento, dove posso appaiare due basi azotate sbagliate come A-C o G-T: non è dunque il miglior modo per ridurre la probabilità di mutazioni. La replicazione semiconservativa, dunque, permette di mantenere fedele, divisone dopo divisone, uno dei due filamenti. La replicazione può avvenire anche in una modalità differente: le cellule staminali vanno incontro alla divisone in cui si conservano i due filamenti a sé stessa: la cellula staminale che tenderà a mantenere la staminalità mantiene i filamenti vecchi. Quindi questo porta a 0 il rischio di mutazione per la cellula staminale ma mi aumenta la probabilità di avere mutazioni nella cellula figlia, ma questo non è importante perché la cellula figlia ha vita breve e quindi il difetto è ininfluente. La staminale va a creare in maniera continua la progenie e può dunque tollerare il difetto presente nelle cellule figlie. Diverso è se una mutazione colpisce la cellula staminale, in quanto poi anche le cellule figlie erediteranno questa mutazione, creando un danno significativo. 2Importante: il DNA e l’RNA hanno zuccheri diversi (rispettivamente desossiribosio e ribosio), il DNA ha la timina mentre l’RNA ha l’uracile. Un’altra importante differenza è che l’RNA è a singolo filamento. Il promotore è quella parte del DNA che decide se un gene è espresso o meno: questa è la regolazione dell’espressione genica che consente ad una cellula di esplicare una determinata funzione, come per esempio i coni e i bastoncelli, che hanno due funzioni diverse: i primi sono responsabili della visione diurna, mentre i secondi anche della visione notturna ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI Negli eucarioti rispetto ai procarioti è più complesso: il DNA è compattato all’interno del nucleo ed è qui che entrano in gioco le proteine: all’interno del nostro nucleo abbiamo metà DNA e metà proteine, legate a punti specifici con un ruolo importante. Perché questo nucleo è fortemente compattato? Un nucleo è grande all’incirca 5-6 μm (i globuli rossi 6-7 μm). La molecola di DNA è lunga all’incirca 2m. Qui entrano in gioco gli istoni, le proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico. Sono proteine che tengono impacchettato il DNA nel nucleo. Quello delle proteine è anche un sistema di protezione per il DNA; inoltre, gli istoni regolano l’espressione genica (o genetica): modalità con cui i geni (DNA) possono essere attivati (o accesi o espressi o codificati) o repressi (o silenti o non codificati) 08/10/21 La cromatina si presenta in due forme: eucromatina ed eterocromatina. L’eterocromatina corrisponde all’80% del DNA nucleare; sono porzioni di DNA geneticamente inattive, in quanto non vengono trascritte perché sono zone del DNA troppo compatte e inaccessibili all’RNA polimerasi. L’eterocromatina è ricca di sequenze ripetute di DNA ed esiste in due forme: • eterocromatina costitutiva: è una struttura ripetitiva priva di valore genico, che quindi non codifica • eterocromatina facoltativa: è così denominata perché in particolari condizioni sia naturali che sperimentali è in grado di trasformarsi in eucromatina, ossia in cromatina attiva nella trascrizione di RNA. Nell’eterocromatina facoltativa i geni sono repressi e le sequenze di geni repressi sono diverse da un tipo cellulare all’altro e, a seconda del tipo cellulare, i geni che si esprimono non sono sempre gli stessi: questo meccanismo sta alla base della differenziazione cellulare L’eucromatina nelle zone, dette in microscopia ottica intercromatiniche, le fibre cromatiniche sono poco condensate e perciò sono geneticamente attive. Questa eucromatina, formata da DNA non ripetitivo, è sede di processi trascrizionali per la sintesi di RNA messaggero (mRNA) e di trasferimento (tRNA) -Nel processo di replicazione, il DNA impartisce gli ordini per la duplicazione di sé stesso. Si formano 2 molecole identiche. -Nel processo di trascrizione le istruzioni codificate nel DNA sono riportate in una molecola intermedia, l’RNA messaggero, che passa nel citoplasma e porta le informazioni del DNA nel sito cellulare (i ribosomi) dove vengono lette e utilizzate. -Nel processo della traduzione le informazioni del DNA sono trasformate (tradotte) in specifiche proteine. A tale scopo sono necessari altri tipi di RNA, l’RNA ribosomiale, contenuto nei ribosomi, sede dell’effettiva sintesi, e l’RNA di trasferimento, che trasporta gli aminoacidi ai ribosomi. Il processo avviene nel seguente modo: -Il ribosoma si muove lungo l’mRNA e sceglie i tRNA + aminoacido secondo la tripletta che legge -Si forma il legame peptidico tra 2 aminoacidi in posizione corretta 3-il tRNA del primo aminoacido è liberato. Il ribosoma si sposta e legge la successiva tripletta. Arriva il nuovo tRNA + aminoacido. Si forma il nuovo legame peptidico. Il tRNA scarico è liberato. Il processo si ripete -Quando il ribosoma legge una tripletta di fine, il polipeptide si stacca e andrà nello scompartimento cellulare a cui è destinato Il codice genetico è l’insieme di tutte le possibili combinazioni di 4 basi prese a tre per volta: 4 3 = 64 triplette di nucleotidi (codoni). Il codice genetico presenta una serie di interessanti caratteristiche: • contiene un segnale di inizio, rappresentato dal codone AUG (che codifica per l’aminoacido metionina) • contiene segnali di fine lettura, rappresentati da tre codoni di stop (o codoni non senso) • non è ambiguo: un dato codone specifica sempre un unico aminoacido. Per esempio, il codone AUU codifica sempre l’isoleucina (Ile) • è ridondante (o degenerato): quasi tutti gli aminoacidi sono specificati da più di un codone. Per esempio, l’isoleucina è codificata dai codoni AUU, AUC e AUA • è universale: è valido per tutti gli organismi, con pochissime eccezioni ll termine C-value (valore Costante) si riferisce alla quantità di DNA espressa in picogrammi contenuta nel nucleo di una cellula aploide. Il concetto di costante si riferisce alle osservazioni del 1948 di R. Vendrely, secondo cui era presente una notevole costanza nel contenuto di DNA di tutte le cellule di tutti gli individui di una data specie animale 11/10/21 • Polimorfismo (SNPs) è una variazione del DNA con effetto neutrale o senza effetto fenotipico negativo. Quando abbiamo che questa variazione crea un danno abbiamo una mutazione. Infatti, la mutazione è così definita: qualsiasi cambiamento permanente del patrimonio genetico, ossia nella sequenza nucleotidica codificante del DNA, con eventi negativi sul fenotipo (Genetica Medica). Per i batteri in particolar modo, una mutazione crea una resistenza: la cellula batterica cambia grazie all’avvento di una mutazione la sequenza amminoacidica di una determinata proteina e se questa stessa proteina veniva riconosciuta da un farmaco, è chiaro che verrà meno l’interazione tra quell’antibiotico e la proteina che è cambiata. Questo è noto come farmaco resistenza. Quando si parla di classificazione di mutazioni si apre un mondo: • mutazioni somatiche: mutazioni che avvengono nelle cellule del nostro corpo, per esempio nelle cellule dell’occhio o del pancreas (appunto le cellule somatiche) • mutazioni germinali, se la mutazione interessa le cellule dei gameti, quindi gli spermatozoi e la cellula uovo Quando parlo di mutazione somatica o germinale già implico nel termine che non è una mutazione che si esplica ovunque: sono correlate al distretto (alla parte del corpo) che è coinvolto. Il cancro rientra nelle mutazioni somatiche perché quando vado ad analizzare le cellule tumorigeniche, poco importa di che cancro stiamo parlando perché stiamo parlando di un distretto cellulare interessato, ad esempio il pancreas. Quando parlo del gene che causa il cancro della mammella, non parlo di una mutazione somatica perché è una mutazione che il soggetto ha ereditato, non è una mutazione de novo, è una mutazione che ha in tutte le sue cellule. Quindi una mutazione de novo (o ex-novo) è una mutazione che effettivamente non c’è, possiede un fenotipo aberrante e non è ereditabile. Quando parliamo invece di tipo di alterazione è riferita al fatto se sono mutazioni che coinvolgono un gene 4(mutazioni geniche o puntiformi) o un cromosoma (mutazioni cromosomiche). Molto importante è la modalità di trasmissione e in tal senso l’albero genealogico è il modo più semplice per poter delineare una malattia genetica e dire se la stessa malattia è dominante, recessiva, X-Linked o De novo-Sporadica. Sporadica indica che non c’è un’ereditarietà, perché sono mutazioni che i genitori non hanno. Una mutazione de novo non è ereditaria, ma una volta che il soggetto ne è affetto, esso può trasmetterla alla progenie; un qualche evento l’ha fatta insorgere, però di fatto non era prevedibile, in quanto non c’è ereditarietà Chi le causa queste mutazioni? Si parla a questo punto di mutazioni di natura spontanea o indotta: spontaneo è un qualcosa in cui non necessariamente c’è un evento esterno che va a perturbare un qualcosa, è accaduto e basta. Spontaneo = naturale, come l’invecchiamento. Indotto invece è un qualsiasi evento che va a contrastare fenomeni come la fertilità. Quando la mutazione è dovuta a cause naturali, quindi insorge spontaneamente, il difetto è da rintracciare o nella ricombinazione (crossing over), nella replicazione (duplicazione semiconservativa) o nella riparazione del DNA. In ogni ciclo cellulare abbiamo 3 miliardi di basi che verranno copiate e quindi dobbiamo accettare che ci siano degli errori e in questo caso interviene il meccanismo di riparazione del DNA: quest’ultimo non interviene soltanto quando meccanismi esterni causano questi errori, ma interviene anche quando ci sono delle incongruenze durante la fase S. Il processo di replicazione del DNA rappresenta di fatto la principale fonte di mutazioni. Tutti gli organismi possiedono due meccanismi fondamentali di salvaguardia della fedeltà dell’informazione molecolare e quindi di ridurre i rischi di mutazioni: • correzione di bozze: correzione degli errori di appaiamento commessi dalla DNA polimerasi mentre la replicazione è in corso. È un meccanismo che abbiamo per ridurre l’insorgenza delle mutazioni. Un appaiamento non canonico (tipo G-T o A-C) si dice miss-match: in questo caso il meccanismo di correzione di bozze va a correggere questo errore. Il meccanismo di correzione di bozze interviene nel correggere gli appaiamenti errati anche dopo la replicazione del DNA; quindi, c’è un ulteriore check per verificare se la replicazione è avvenuta nel modo corretto o meno. Sono enzimi che fanno questi ripari del DNA ed essendo enzimi sono geni, quindi codificano una proteina. L’enzima è una proteina che è coinvolta in una reazione. Siamo dotati quindi di una serie di enzimi capaci di correggere danni che il nostro DNA può subire dall’esterno, in particolar modo con le radiazioni. Un altro evento chiamato in causa è la ricombinazione o crossing over, è un evento molto importante in biologia che sta alla base della nostra variabilità: è un meccanismo che consente di creare delle versioni uniche di cromosomi e quindi, per ogni cromosoma, non avrò il cromosoma parentale come mi è stato trasmesso dalla mamma e il papà, grazie proprio alla ricombinazione che consente di scambiare dei segmenti di cromatidi non fratelli. Questi chiasmi, questi eventi di scambio avvengono anche all’interno dei geni (intragenica) e avvengono anche all’interno degli esoni. Il crossing over è un processo biologico spontaneo che fa parte (come la trascrizione, come la replicazione) dei nostri processi biologici. È la ricombinazione che fa sì che noi abbiamo spermatozoi differenti. I cromatidi fratelli sono il risultato della duplicazione, è quindi la copia fedele di quel segmento di DNA. Questo crossing over richiede un apparato enzimatico importante. Quando abbiamo parlato di queste mutazioni che insorgono è importante sapere che se le mutazioni sono causate da duplicazione del DNA in primis è chiaro subito che il sito dove insorgono queste mutazioni può essere la spermatogenesi. Se io trovo una mutazione germinale, e quindi una mutazione dei gameti, statisticamente non posso non pensare che questo processo venga chiamato in causa perché ha nella sua natura un rischio alto dal momento che produce tantissime fasi S e quindi tantissime duplicazioni del DNA. Se faccio un confronto con l’ovogenesi, la storia è completamente diversa: nell’ovogenesi non ci sono fasi S e quindi questo processo di ovogenesi ci salvaguardia dalle mutazioni puntiformi. Questo processo mi può però destabilizzare una non corretta segregazione dei cromosomi, ovvero non vanno in maniera equilibrata ai rispettivi poli ma possono migrare contemporaneamente ai due rispettivi poli. Se i cromosomi migrano 5entrambi in un polo, l’altro polo ne rimane privo e l’ovocita rimane privo del cromosoma; arriva lo spermatozoo che però incontrerà una sola copia di quel cromosoma: è il caso della monosomia. È più bassa la probabilità che questi eventi accadano nel maschio. Quando abbiamo mutazioni de novo la prima causa è la spermatogenesi. Una mutazione che mi compare nello spermatozoo, che andrà a fecondare, come errore nella fase S è una mutazione germinale di origine paterna. Se la mutazione è negli spermatogoni, spesso ritroviamo dei mosaicismi germinali, ovvero andremo ad ottenere un liquido seminale misto, composto da spermatozoi che vengono da cellule normali ma anche da cellule mutate Quando parliamo di mutazioni indotte il tasso di mutazione aumenta enormemente. Se avessimo parlato di quelle spontanee, gli eventi sarebbero stati molto rari. Quando invece c’è qualcosa nell’aria che respiro, che mangio o comunque qualcosa di indotto come i mutageni chimici il rischio aumenta e si entra nel contesto della mutagenesi ambientale. I mutageni chimici sono quelle sostanze, in primis molecole, che si combinano con il DNA penetrando all’interno delle cellule attraverso l’involucro nucleare e qui causano danni alle nostre basi nucleotidiche oppure, ancora peggio, sono molecole simili alle basi e perciò sono incorporate per errore da parte della DNA polimerasi causando errori. I mutageni chimici, quindi, possono causare sostituzioni di nucleotidi oppure inserzioni o delezioni di nucleotidi I mutageni fisici, come i chimici, fanno danni al DNA ma hanno un’altra composizione e sono: radiazioni UV a bassa energia e poco penetranti, i raggi X, ovvero radiazioni ionizzanti ad alta energia e altamente penetranti. Se queste radiazioni riescono ad arrivare al DNA inducono, in particolar modo gli UV, la formazione di dimeri di timina. Cosa succede a questo segmento? Se questo è un gene ed era il primo nucleotide di un codone non ha più quel significato genetico e crea un danno enorme, perché poi si replicherà e userà come filamento stampo quello sbagliato con la doppia timina perché la DNA polimerasi non riesce a riconoscere questo errore. Il meccanismo di mutagenicità radiazioni ionizzanti è più pericoloso perché ha un danno più alto; infatti, si possono avere la rottura di un singolo filamento oppure la rottura del doppio filamento, modificazione chimica delle basi o la rimozione di singole basi Le mutazioni germinali colpiscono i gameti e possono essere trasmesse alla prole, mentre le mutazioni somatiche non hanno questo rischio di essere trasmesse alla prole, si esauriscono nell’individuo, sono mutazioni che riguardano un tessuto specifico e che vengono trasmesse alla progenie della cellula colpita e dunque rimane delimitata in quel determinato tessuto. In entrambi i casi possiamo parlare di mosaicismo, ovvero un fenomeno per cui un individuo presenta regioni del corpo caratterizzate da linee cellulari che, sebbene derivino dallo stesso zigote da cui derivano le altre, possiedono un patrimonio genetico alterato in seguito a mutazioni somatiche; la massima espressione di mutazione somatica è il cancro. Se poi una mutazione avviene in una cellula che poi perdiamo non avremo traccia di quel ritrovamento genetico 13/10/21 DIVERSI TIPI DI MUTAZIONI • Mutazione genica: evento per cui un gene si trasforma da una forma allelica ad un’altra e il nuovo allele è ereditato secondo le leggi di Mendel. Il gene mutato è trasmesso poi alla prole. In generale, una mutazione genica non è necessariamente patogenica • Retromutazione: mutazione da un allele anormale ad un allele standard, quindi il contrario del caso precedente • Mutazione morfologica: mutazione che si esprime in un’alterazione della forma dell’organismo 6• Mutazioni letali, subletali e determinali: mutazioni che determinano la morte, la bassissima sopravvivenza o il danneggiamento dell’organismo. Le mutazioni letali le ho nel caso di omozigosi, in cui entrambi gli alleli sono mutati e questo comporta l’incompatibilità con la vita; nel caso dell’eterozigosi ho invece un gene mutato e l’altro normale, questo comporta che l’individuo abbia la patologia che però non è incompatibile con la vita • Mutazioni condizionali: mutazioni in cui il fenotipo si manifesta solo in particolari condizioni ambientali come il pH, temperature, CO 2 … • Mutazioni biochimiche: mutazioni che determinano la perdita o il cambiamento di un passaggio biochimico; sono mutazioni degli enzimi che fanno determinate reazioni metaboliche ed è chiaro che se ho un enzima mutato il processo non va a buon fine • Mutazioni nutrizionali: mutazione per cui microrganismi passano da un genotipo standard con cui è possibile la crescita con un terreno minimo (prototrofi) a un nuovo genotipo in cui è richiesta la somministrazione supplementare di specifiche sostanze (auxotrofi). È una mutazione che non consente di creare la biosintesi di sostanze essenziali e quindi è necessaria l’aggiunta di sostanze esterne • Mutazioni per resistenza: mutazioni che determinano la capacità di resistere a sostanze tossiche (o a farmaci) o a organismi patogeni cui invece il genotipo standard è sensibile. MUTAZIONI CROMOSOMICHE Le mutazioni cromosomiche possono essere di due tipi: • mutazioni del numero di cromosomi: monosomie, trisomie… • mutazioni nella struttura: posso avere anche 46 cromosomi ma al contempo anche delle alterazioni da parte dei cromosomi come traslocazione, inversione, delezioni… MUTAZIONI GENICHE Le mutazioni geniche sono definite anche puntiformi e sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un ‘altra. Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o all’aggiunta (inserzione o duplicazione) di una base nel filamento del DNA La sostituzione di una base nucleotidica con un’altra può avere conseguenze più o meno gravi sul prodotto finale, ovvero la proteina specificata da quel gene. In base alle conseguenze che se ne hanno distinguiamo 3 tipi: • mutazioni silenti: se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso amminoacido e la proteina prodotta sarà la stessa. Le mutazioni silenti riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido. È una sostituzione in terza base ma codifica lo stesso aminoacido • mutazioni di senso (missenso): nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido. Se vado a modificare il primo nucleotide della tripletta CCU e ottengo GCU passo dalla prolina all’alanina. È patologica? Dipende. Quando cambio un aminoacido con un altro la prima cosa che devo prendere in considerazione è l’entità del cambio: vado a fare un confronto. Un aminoacido si diversifica da un altro per il gruppo R, che diventa più complicato man mano che vado avanti, non solo dal punto di vista strutturale, ma anche dal punto di vista dell’ingombro. Certe sostituzioni del gruppo R possono essere quindi tollerate, mentre altre possono risultare devastanti. Un esempio di mutazione missenso l’abbiamo nell’anemia falciforme, in cui si verifica una mutazione missenso nel gene β-globina. L’acido glutamminico in posizione 6, carico negativamente, (ovvero posizione dei nucleotidi 16-18) viene sostituito dalla Valina (idrofobico). Da un punto di vista delle interazioni, la 7valina in posizione 6 interagisce con un'altra valina e questo causa una formazione di aggregati molecolari che precipitano nel globulo rosso. L’emoglobina anziché avere una struttura a tetramero, in conseguenza della mutazione avrà una struttura completamente diversa, degli aggregati molecolari con un peso importante che quindi causa una precipitazione nel caso del globulo rosso e non solo, perché alterano anche la struttura dei globuli rossi e questo poi si traduce con l’impossibilità di espletare la propria funzione, ovvero quella di trasportare ossigeno. Un altro esempio di mutazione missenso è quello della sindrome AEC, compatibile con la vita, ma causa danni agli arti, alla pelle e alla vista. Sono tutti esempi che dimostrano come la sostituzione di un aminoacido possa produrre delle patologie più o meno gravi. La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l’aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della sostituzione. La sequenza di una proteina, ad esempio l’emoglobina, dell’uomo, del maiale, del cane o del cavallo differisce per parecchi aminoacidi ma tuttavia tutte queste emoglobine svolgono la funzione in modo efficiente. Alcune regioni della proteina sono molto simili anche tra specie filogeneticamente lontane (ad esempio nell’emoglobina la regione dell’eme). Si dice in gergo tecnico che questa è una regione ben conservata • Mutazioni nonsenso: mutazione in cui la sostituzione del nucleotide, in seconda base, porta alla formazione di un codone di stop: UGG → UAG. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione). Una mutazione nonsenso porterà dunque alla sintesi di una proteina tronca: se ho uno stop dopo 4-5 aminoacidi, l’effetto è devastante; ma lo è anche se interrompiamo la sintesi di una proteina lunga 1000 aminoacidi dopo 800-900 aminoacidi perché la genetica ci insegna che anche un aminoacido diverso può portare a patologie, quindi a maggior ragione anche averne 4-5 o addirittura 100 o 200. Lo stop dunque porta in ogni caso a patogenicità • Mutazioni di frame-shift: le mutazioni frame-shift o di slittamento del modulo di lettura consistono nell’inserzione o delezione di un numero di nucleotidi non divisibile per 3 (1,2,4,5,7,8,10…) con conseguente sfasamento della cornice di lettura delle triplette dell’RNA messaggero. Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del DNA. Atre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base. In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata. Nel caso di inserzione (inserimento) di una base, la parte a monte rimane invariata, mentre sfalsa la lettura della porzione codificante a valle dell’inserimento della base. Se c’è una delezione di un nucleotide, avrò uno spostamento della griglia a valle della perdita. Una delezione meno drammatica potrebbe essere la delezione di un intero codone: in questo caso avrò la produzione di una proteina priva dell’amminoacido associato al codone perso. In questo caso, la perdita della tripletta di nucleotidi potrebbe venire tollerata. Se si verifica una delle tre mutazioni sopra citate, il fenotipo che ne deriva è lo stesso, in quanto in questi casi produco una proteina non funzionale. • Mutazione causativa Una variazione della sequenza del DNA… …che è trovata solo negli individui affetti …che non è mai ritrovata in quelli non affetti …che spiega il processo patologico 8…che, quando corretta nel tempo, fa recuperare un fenotipo normale Queste definizioni sono applicabili quando ho a che fare con una malattia dominante perché queste frasi sono riconducibili ad una malattia dominante in cui è sufficiente un’alterazione in un allele. Nelle malattie recessive le dovrò modificare perché compare un altro individuo che è il portatore. In genetica, il carattere che per noi è l’allele, è dominante se nell’eterozigote predomina uno dei due caratteri sull’altro MALATTIE in medicina la malattia è: • dominante: fenotipo clinicamente malato, manifesto con 1 allele mutato • recessiva: fenotipo clinicamente manifesto con 2 alleli (sempre riferiti ad un singolo gene) mutati (omozigote o eterozigote composto). Ciascuno di noi possiede 2 copie di ogni gene contenuto nei cromosomi. Ognuna delle due copie è detta allele. Un allele proviene dal padre (allele paterno) e uno dalla madre (allele materno). Non sempre gli alleli sono uguali fra loro, anzi spesso presentano delle differenze. Gli alleli sono quindi versioni diverse dello stesso gene. Un allele può essere dominante (A) o recessivo (a): • Se un individuo possiede 2 alleli uguali dello stesso gene si dice omozigote (AA o aa). Se si verifica una mutazione, entrambi gli alleli sono mutati. È proprio questa la situazione di omozigosità recessiva, ovvero ho due alleli omozigoti ma mutati • Se un individuo possiede 2 alleli diversi dello stesso gene si dice eterozigote (Aa). Se si verifica una mutazione, un allele è mutato, l’altro è normale. L’eterozigote per le malattie dominanti, è malato, mentre per le malattie recessive è sano, è solo un portatore La consanguineità aumenta il tasso di omozigosità (due alleli identici) e quindi di produrre un figlio malato. Il matrimonio misto, ovvero con un partner non consanguineo, mi consente di avere figli malati con una bassissima probabilità, perché se io porto una mutazione, la probabilità che anche il partner abbia la mia stessa mutazione è prossima allo 0. Ogni individuo è portatore sano di almeno 8 malattie genetiche recessive, di cui 3 letali Fratelli, genitori-figli ¼ omozigosi Fratellastri, zii-nipoti 1/8 omozigosi cugini diretti 1/16 omozigosi secondi cugini 1/64 omozigosi • L’eterozigosità composta è quella situazione delle malattie recessive in cui ho 2 alleli mutati, ma la mutazione è diversa. L’alto numero di portatori è un fattore di rischio per l’eterozigosi composta (due mutazioni di nome diverso nei due alleli). Da non confondere con la digenica: eterozigosità (e omozigosità) è riferito sempre alla coppia di alleli di un gene: allele P63 tipo 1, allele P63 tipo 2. Quando invece ho una mutazione nel P63 e una mutazione nel P73 sei un eterozigote digenico perché sei portatore di due mutazioni recessive ma in due geni coinvolti nella medesima funzione 918/10/21 Dalla slide 108 (prima figura sottostante posta a sinistra) si può notare che l’individuo o è sano o è malato perché quando uno dei due alleli è mutato è sufficiente per espletare una condizione patologica e questo implica che per le malattie dominanti non esiste il concetto di portatore sano. Nel caso delle malattie recessive abbiamo 3 colori (slide 110, figura sottostante posta a destra) perché qui la condizione che dobbiamo soddisfare è di avere due alleli mutati per questo determinato locus genico: per poter avere la condizione patologica tutti e due gli alleli devono essere mutati. Questo si verifica quando mamma e papà erano portatori sani della malattia: in tal caso, ho il 25% di probabilità di trasmettere la malattia alla progenie. È chiaro che ora devo distinguere se di fatto i due alleli mutati portano la stessa mutazione (omozigosità recessiva) o se ho una diversa mutazione di un allele verso l’altro (eterozigosità composta). L’eterozigosità composta per definizione non nasconde un’ereditarietà comune: i due genitori, avendo due mutazioni diverse, è ovvio che non sono imparentati e quindi questa è una situazione di sfortuna. Diverso è se parliamo di omozigosità recessiva perché su 60000 alleli che abbiamo, ho una probabilità bassissima di avere la stessa mutazione in un allele, ma questa possibilità aumenta in maniera proporzionale al grado di parentela: se era mio nonno che aveva questa determinata mutazione, ce l’abbiamo tutti in famiglia; con i matrimoni tra consanguinei, passiamo da una situazione di eterozigosità ad una di omozigosità. Quando però questo si esplica? Se ho una mutazione in condizioni di eterozigosità e faccio figli con mia cugina, anch’essa in eterozigosità, quest’ultimi saranno in condizioni di omozigosi e quindi aumenta il grado di omozigosità. Il grado di omozigosità, ovvero avere due alleli mutati uguali, è un evento che statisticamente non dovrebbe mai accadere, perché anche supponendo che io abbia 10 alleli mutati e anche un’altra persona che viene da una discendenza lontana dalla mia ha altri 10 alleli mutati, la possibilità di avere la stessa mutazione entrambi, è prossima allo 0. Questo non significa che non accadrà mai, ma è un evento rarissimo. Questi eventi diventano numericamente palpabili quando abbiamo invece matrimoni tra consanguinei: più sono parenti e più alta è la probabilità di avere numerose mutazioni in omozigosi e quindi di avere malattie 10LEGGE DI HARDY-WEINBERG Ammettiamo di avere 10 mutazioni in media, ognuno nei propri genomi; questo numero è una costante? Può aumentare o diminuire? Nelle discendenze le frequenze di questi alleli mutati rimangono uguali, aumentano o diminuiscono e quali sono i fattori che possono condizionare eventualmente questo numero? Legge di Hardy-Weinberg: definirono “popolazione in equilibrio” una popolazione all’interno della quale le frequenze degli alleli mutati rimangono costanti da una generazione all’altra e le frequenze genotipiche sono ricavabili da quelle alleliche: il numero di frequenze degli alleli mutati, se la popolazione è in equilibrio, non verrà alterato. Supponiamo di introdurre all’interno del nostro corpo una sostanza che ci fa male, anche un virus, e che inizia a rompere il DNA: le frequenze dovrebbero aumentare e questo non lo vedi da persona a persona, ma lo vedi nelle generazioni; se uno studia 200 anni di storia, vede che effettivamente le frequenze partono ad esempio da 8, poi passano a 12, 14, 20, 40, 50… il DNA sta subendo delle mutazioni quando la frequenza degli alleli mutati sta aumentando nelle generazioni Le condizioni che devono essere soddisfatte affinché una popolazione si trovi all’equilibrio di Hardy- Weinberg (HWE) sono le seguenti: • Gli accoppiamenti devono essere casuali • La popolazione deve essere di grandi dimensioni (teoricamente infinita): fa eccezione l’isolato genetico perché se ad esempio prendiamo un gruppo di individui e li portiamo su di un isola, questo cozza con l’ipotesi numero due, in quanto la popolazione non è di grandi dimensioni • Non deve esserci flusso genico (migrazioni di alleli dentro o fuori una popolazione): quando ci sono alleli che vengono da un'altra popolazione, porteranno il loro contributo genetico e questo mi comporta una variazione della frequenza allelica perché devo tenere conto dei nuovi alleli che stanno arrivando a causa del flusso genico • Non ci devono essere mutazioni (o meglio fattori di rischio che aumentano la frequenza di queste mutazioni) • Non si deve verificare selezione naturale, cioè eventi drastici che possono in qualche modo creare una risposta genetica di adattamento Se queste condizioni sono idealmente soddisfatte, le frequenze alleliche entro una popolazione rimangono costanti per un periodo indefinito di tempo GENETICA DELLE POPOLAZIONI La genetica delle popolazioni è una branca della biologia che studia la costituzione genetica delle popolazioni biologiche e del cambiamento di questa composizione per l'influsso delle quattro forze evolutive: selezione naturale, deriva genetica, mutazione e migrazione. È cioè lo studio dell'origine e della dinamica della variabilità genetica fra individui e popolazioni nel tempo e nello spazio. È attraverso questi studi che si sa da dove discendiamo e anche quali sono le prime popolazioni che si sono formate e anche a questo punto sapere qual è il DNA ultimo, cioè quello più evoluto che verosimilmente sono gli australiani. Il termine "popolazione" può essere definito in vari modi, ma nel senso più comune della parola, è un insieme di persone o organismi di una particolare specie vivente in una determinata area geografica. In biologia, una popolazione è la più piccola unità nella quale è possibile il cambiamento evolutivo, perché permette l'origine di nuovi alleli e il cambiamento della loro frequenza. La variabilità genetica è la base sulla quale agisce l'evoluzione ETEROZIGOSITA’ COMPOSTA, EREDITARIETA’ DIGIENICA E TRIALLELICA Non devo confondere l’eterozigosità composta con l’ereditarietà digenica: ho sempre 2 mutazioni, ma in quest’ultima ho 2 mutazioni in 2 geni distinti (P63 e P73 ad esempio) coinvolti nella stessa funzione e quindi 11
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